엔도톡신 시험법과 측정법 적합성 시험 가이드라인
1. 엔도톡신 시험이란?
엔도톡신(Endotoxin)은 그람 음성균의 세포벽(특히 LPS, lipopolysaccharide)에서 유래한 독성 물질입니다.
의약품, 의료기기, 생물학적 제제에는 이런 엔도톡신이 허용 기준 이상으로 들어있으면 심각한 부작용(발열, 쇼크 등)을 일으킬 수 있습니다.
따라서 의약품 제조 과정에서는 엔도톡신 오염 여부를 반드시 시험해야 하며, 이때 사용하는 것이 바로 LAL(Limulus Amebocyte Lysate) 시험법입니다.
흔히 사용하는 방법은 다음 세 가지입니다:
- 겔 클로팅법(Gel Clot)
- 광학비측정법(Kinetic Turbidimetric 또는 Chromogenic)
- 비색측정법(Kinetic Chromogenic Assay)
모두 'LAL 시약'을 이용해 엔도톡신 존재 여부를 감지하는 방법입니다.
2. 측정법 적합성 시험이란?
제품 성분에 따라 LAL 반응이 방해(억제 또는 강화)될 수 있습니다.
예를 들어, 제품 안에 있는 단백질, 금속 이온, 계면활성제 등이 LAL 반응을 방해할 수 있습니다.
그래서 엔도톡신 시험을 시작하기 전에 반드시 제품별로 측정법 적합성 시험(Method Suitability Test) 을 수행해야 합니다.
목적:
- 제품이 LAL 반응에 방해를 주지 않는지 확인
- 적절한 희석 조건 설정
방법 요약:
- 제품 시험액에 일정량의 엔도톡신(Spike)을 첨가합니다.
- 회수율(Recovery Rate)이 50~200% 범위에 들어야 합니다.
- 범위를 벗어나면 제품 희석, 배지 변경, 시험법 변경 등을 고려합니다.
3. 실패 사례
[실패 사례 1] 제품 성분에 대한 이해 부족
배경:
A사는 단백질 의약품에 대해 엔도톡신 시험을 수행했습니다.
측정법 적합성 시험을 생략하고 바로 겔 클로팅법으로 시험을 진행했습니다.
결과:
- 시험 결과는 모두 음성(Negative) 판정.
- 제품 출하 후 환자에게 발열 반응 보고.
문제 원인 분석:
- 제품 안의 고농도 단백질이 LAL 반응을 억제한 것으로 밝혀짐.
- 적합성 시험을 하지 않아 방해작용을 미리 파악하지 못함.
[실패 사례 2] 희석 조건 설정 오류
배경:
B사는 주사용 제제에 대해 Kinetic Chromogenic Assay로 시험을 했습니다.
적합성 시험 중 Spike 회수율이 30%에 그쳤지만, 이를 무시하고 시험을 진행했습니다.
결과:
- 시험 결과가 신뢰성 없음.
- 품질 감사(QA) 과정에서 문제 지적.
- 전체 배치 재시험 및 제품 리콜 비용 발생.
문제 원인 분석:
- 1차 희석배수만 적용하고 추가 희석 검토를 소홀히 함.
- 희석에 따른 엔도톡신 희석 효과를 과소평가함.
4. 수정 및 성공 사례
[수정 사례 1] 단백질 제제 시험법 개선
조치:
- 제품 시험액을 1:10, 1:100, 1:500으로 순차 희석하여 LAL 반응 방해를 최소화.
- 희석액에는 LAL Reagent Water를 사용해 외부 오염 방지.
- 각 희석 조건별로 Spike Recovery Test를 실시하여, 1:100 희석 시 회수율 80~120%로 적합함을 확인.
결과:
- 시험법 적합성 확보.
- 이후 시험에서 일관되게 신뢰성 있는 결과 도출.
- 제품 출시 지연 없이 진행.
[수정 사례 2] 희석 조건 다단계 검토
조치:
- 초기 적합성 시험에서 1차 희석 회수율 불량(30%) 확인.
- 추가로 1:5, 1:10, 1:20 희석을 검토하여 최적 조건 선정.
- 최종적으로 1:10 희석에서 Spike Recovery 95% 확보.
- 모든 시험 데이터 QA에 보고 및 승인.
결과:
- 감사 대응 성공.
- 품질 보증 신뢰도 향상.
5. 엔도톡신 시험 시 주의사항 요약
구분주의사항
| 시험 전 | 시험 환경, 기구, 시약이 엔도톡신 프리인지 확인 |
| 시험 방법 | 제품 특성을 고려해 적절한 시험법(Gel Clot/Turbidimetric/Chromogenic) 선택 |
| 적합성 시험 | Spike Recovery 50~200% 확보 여부 확인 |
| 희석 조건 | 제품 방해 작용 존재 시 추가 희석 검토 |
| 문서화 | 모든 적합성 시험 결과를 기록하고 QA 승인 받을 것 |